SB色譜柱由泵將儲液瓶中的溶劑吸入色譜系統，然后輸出，經流量與壓力測量之后，導入進樣器。被測物由進樣器注入，并隨流動相通過色譜柱，在柱上進行分離后進入檢測器，檢測信號由數據處理設備采集與處理，并記錄色譜圖。廢液流入廢液瓶。

　　儲液器中的流動相被高壓泵打入系統,樣品溶液經進樣器進入流動相,被流動相載入色譜柱(固定相) 內, 由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數, 在兩相中作相對運動時, 經過反復多次的吸附- 解吸的分配過程,各組分在移動速度上產生較大的差別, 被分離成單個組分依次從柱內流出, 通過檢測器時, 樣品濃度被轉換成電信號傳送到記錄儀,數據以圖譜形式打印出來。

　　SB色譜柱遇到復雜的混合物分離（極性范圍比較寬）還可用梯度控制器作梯度洗脫。這和氣相色譜的程序升溫類似，不同的是氣相色譜改變溫度，而HPLC改變的是流動相極性，使樣品各組分在條件下得以分離。

　　同其他色譜過程一樣，HPLC也是溶質在固定相和流動相之間進行的一種連續多次交換過程。它借溶質在兩相間分配系數、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質得以分離。

　　開始樣品加在柱頭上，假設樣品中含有3個組分，A、B和C，隨流動相一起進入色譜柱，開始在固定相和流動相之間進行分配。分配系數小的組分A不易被固定相阻留，較早地流出色譜柱。分配系數大的組分C在固定相上滯留時間長，較晚流出色譜柱。組分B的分配系數介于A，C之間，第二個流出色譜柱。若一個含有多個組分的混合物進入系統，則混合物中各組分按其在兩相間分配系數的不同先后流出色譜柱，達到分離之目的。

　　SB色譜柱不同組分在色譜過程中的分離情況，首先取決于各組分在兩相間的分配系數、吸附能力、親和力等是否有差異，這是熱力學平衡問題，也是分離的首要條件。